[目的]：

研究 Ca2＋-calpain/p35 -CDK5/p25 途径在 BDE-153 神经毒性中的作用，为探寻BDE-153 神经发育毒性的机制提供研究线索。

[方法]：

体内实验方法：将出生 10 天的雄性仔鼠按窝别和体重随机分成 4 组，分别设为橄榄油溶剂对照、1mg/kg，5 mg/kg 和 10 mg/kg BDE-153 组，每组 10 只。按 10 ml/kg 一次性腹腔注射染毒。在染毒后 1 月龄和 2 月龄时，用 Morris 水迷宫，跳台实验、避暗实验检测大鼠的神经行为功能，用旷场实验检测大鼠的自发活动能力。染毒 2 月后，用 HE 染色检测大鼠脑组织神经细胞的损伤，并在电镜下观察神经细胞超微结构的改变。用 TUNEL 染色法和流式细胞仪检测大鼠神经细胞凋亡率和 Ca2+浓度，用乳酸脱氢酶检测试剂盒检测LDH 漏出率。Real time QPCR 和 Western Bolt 技术检测 calpain、CDK5 以及 p25 和 p35基因和蛋白表达的改变，ELISA 试剂盒检测 calpain、CDK5/p25 和 CDK5/p35 激酶的活力。体外实验方法：原代培养的处于对数生长期大鼠神经元，经神经元纯度鉴定后，随机分为空白组，DMSO（溶剂）组， 10μmol/L BDE-153, 20μmol/L BDE-153， 40μmol/LBDE-153，染毒 48h后，显微镜下观察原代神经细染毒后的形态学改变，CCK-8 法检测细胞的活力，用 LDH 检测试剂盒检测 LDH 漏出率。Hochest33258 染色，AO/EB 双荧光染色以及流式细胞仪等方法观察和检测神经细胞的凋亡情况、细胞内 Ca2+浓度；Realtime QPCR 技术、免疫荧光技术检测 calpain、CDK5 以及 p35 基因和蛋白表达的改变，并用 ELISA试剂盒检测 calpain、CDK5/p25 和 CDK5/p35 激酶活力。另外，采用 PD150606抑制 calpain 后，CCK-8 法检测神经细胞活力，ELISA试剂盒检测 calpain，CDK5/p25 和CDK5/p35 激酶活力的改变。

[主要试剂和仪器]

CCK-8 （Cell Counting Kit-8）,dojindo 株式会社

ELISA检测试剂盒，上海江莱生物

酶标分析仪，BIO-RAD680 型，美国 Bio Rad 公司

caplain 抑制剂 PD150606：5mg 的 PD150606 离心后用 2.72ml DMSO 充分溶解，则配成 浓 度 为 6mmol/L 的 贮 备 液 ， 取 0.73μl 稀 释 成 5mmol/L, 逐 步 配 制 成 4mmol/L,2.5mmol/L,2mmol/L,1mmol/L,0.5mmol/L 的使用液。

江莱生物产品文献：Ca_2_calpain_p35_省略_DE_153神经毒性中的作用研究