在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加样本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育。

温育这一步是ELISA测定中最容易出现问题的步骤。目前市面上的商品化试剂盒的反应温育时间一般为30~120分钟，温育时间若不够，可能会影响测定下限。

ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

在一定温度范围内，温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。

温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃（冰箱温度）等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。

在建立ELISA方法作反应动力学研究时，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

温育方式常采用温箱法、微波辐射法和水浴法。其中水浴法能较好解决因受热不均衡所致的周围孔与中央孔结果的吸光度差异（“边缘效应”即外周孔显色较中心孔深）。可将ELISA板置于水浴箱中，板底应贴着水面，使温度迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。

若用温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料（如金属等），在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。为避免酶标板底部受水汽或磨损导致的读数误差，一般采用鼓风恒温箱保温，这个过程必须在酶标板上方贴封纸，以免蒸发。

无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。

室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证时间精确，一个人一次不宜多于两块板同时操作、测定。

●  不同的温育环境对检测结果有影响，操作中应严格按照说明书控制温育时间及温度，并注意封闭避免边缘效应。

●  为确保各板温度都能迅速达到平衡，不可将反应板叠加放置，设定的温度及时间严格按照说明书进行，一般加入待测样本后使其与固相抗原(抗体)置于37℃环境下温育。因为很多恒温箱的构造，温度及检测的温度并非酶标板温育温度，所以使用恒温箱温育时建议将温度计置于酶标板旁，保证酶标板旁温度为37℃。

●  干育和水温的影响差异较为明显，建议使用水温，注意将固相板放入水中，防止受热不均匀。

●  试剂盒一般设定的反应温度为 37℃，在这个温度下放置 30 分钟，蒸腾的水分会许多，对于全部反应体系来讲，各种反应物的浓度会不断增加，这么必会致使反应最终的OD值增加，温育时贴封片或加盖，避免标本或稀释液蒸发。

●  试剂盒设定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点，提高反应的温度，会加速反应，一样延长时间会影响反应，这样得到的反应程度会比试剂盒断定的反应程度深，也会引起阴性高值或假阳性。

实验操作的严谨性与实验操作规范密不可分，未使用的试剂应储存于2-8℃，使用时应回温到室温（20-25℃）。切忌不同批次的试剂混合使用，要经常检查酶标仪和微量移液器的精度和准备度…… ELISA看起来很简单，但是在实际操作过程中，绝不能掉以轻心，除了严谨规范的实验操作，高品质的试剂盒与专业的技术团队也是获得准确结果的保证！

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