主要试剂
1、标本和细胞培养液:同形态学检测法。
2、3H-TbR:比放射性5.5-7.4×10】12Bq/mmol,用时每管加20μl即可,最终浓度为3.7×10】4Bq/ml。
3、闪烁液:取4.0g 2,5-二苯基恶唑(PPO)、0.4g 1,4双(5-苯基恶唑基-2)苯(POPOP)加入1000ml二甲苯中。
4、其他试剂:50.0g/L三氯醋酸、无水乙醇。
操作步骤
1、按形态学方法进行血培养,孵育至72h收获,如用特异抗原代替PHA,则孵育至120h收获。在收获前8h加入3H-TdR。
2、培养完毕,轻轻吸出培养液,在沉淀细胞悬液中加入6ml蒸馏水,低渗破坏红细胞,加入35.0g/L NaCl 2ml调回等渗状态。
3、离心1000rpm 10min,弃上清液。每管加2ml生理盐水后,滴入装在抽滤装置上的49型玻璃纤维滤片中央,用10ml生理盐水冲洗样品管,使其在全部滴在滤片上。
4、滴加50.0g/L三氯醋酸2-3ml,固定样品,再滴加无水乙醇1-2ml脱色和脱水。如果测定标本多,最好用多道细胞收集器进行收获,第2-4步可一次完成。
5、取下滤片,置80℃烘箱30min烘干。
6、将烘干的滤片放入盛有5ml闪烁液的小瓶中,使滴加样品的一面朝上,用液体闪烁仪测其cpm值。
注意事项
1、培养瓶的玻璃质量可影响转化率,故选用中性玻璃的小瓶(可用链霉素或胰岛素瓶代替)或试管。培养瓶应有足够的空间,一般用10ml试管加入2ml培养基较好。
2、放射性核素掺入法的影响因素较多,如细胞数、PHA浓度、培养时间、培养液成分3H-TdP的活性等,故应严格控制实验条件。