纸色谱是利用滤纸进行色谱分离的方法。一般认为滤纸本身是惰性载体，而滤纸纤维素所吸附的水是固定相。由于吸附水部分以氢键缔合形式与纤维素的羟基结合在一起，一般难以洗脱，因而纸色谱不仅可以用与水不相混溶的有机溶剂作流动相，而且也可用与水相混溶的有机溶剂作流动相（如丙酮、乙醇等与水混合的溶液作流动相）。

纸色谱操作方法如下：
1、点样。取滤纸条，在接近纸条一端处点上欲分离的试液。试样需溶于适当的溶剂中，最好采用与展开剂极性相似且易于挥发的溶剂，一般可用乙醇、丙酮、氯仿，尽量避免用水作溶剂，因为水溶液斑点易扩散且不易挥发除去。在无机纸色谱操作中也可用水作溶剂；液体试样也可直接点样。纸色谱是一种微量分离方法，所点试样量一般为数微克到数十微克，依显色反应灵敏度和滤纸厚薄及性能而定。点样可用管口平整的玻璃毛细管或微量注射器吸取试液后，轻轻接触滤纸。一张滤纸可并排点数点试液，两点间应距离2cm，点样处离纸端约3-4cm。 。原点愈小愈好，一般直径以2-3mm为宜。如试液太稀，可反复点样数次。每次应待溶剂挥发后再点，以免原点扩散。为了促使溶剂挥发，可用红外灯烘烤或电吹风吹干。

2、展开。一般常用上升法。纸色谱的流动相习惯称作展开剂，层析筒应密闭，筒内应先用展开剂蒸气饱和。上升法设备简单，但展开速度慢。下行法是把试液原点放在纸条接近上端处，而把纸条上端浸入盛展开剂的玻璃槽中，玻璃槽放在架子上，让展开剂沿滤纸条逐渐向下移动。还可采用环行法，即在圆滤纸中心穿一小孔，小孔周围点上试液，小孔中插入一条滤纸条卷成的“灯芯”，另取两只直径比滤纸略小的培养皿，一皿中放展开剂，滤纸则平放在这个培养皿上，上面再罩另一只培养皿以防展开剂挥发。这样展开会形成同心圆的弧形谱带，作径向展开，又称为灯芯法。

若是一次色谱分离不可能把各组分完全分开，则可用双向色谱法。为此可用方形滤纸，在滤纸一角点样，先用一种展开剂朝一个方向展开后，待溶剂挥发后再用另一种展开剂朝原来垂直方向进行第二次展开，如前后两次展开剂选择适当，可以使各种组分完全分离。

3、显色。对于有色物质，展开后即可直接观察到各个色斑。对于无色物质，可应用各种物理的和化学的方法使之显色。最简单的物理方法是用紫外灯照射，观察有机物对紫外光吸收的颜色或经紫外光照射后发出的荧光。亦可采用喷射显色剂的方法显色。显色剂各种各样，只要能观察到色斑均可，通常采用喷雾显色法，即先将显色剂配制成一定浓度的溶液，然后用喷雾器均匀喷洒在滤纸上，要求雾滴细而均匀，喷雾与纸的距离以0.7-1m为宜，且在通风橱中进行。